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Ugo Basile疲劳转棒仪丨大小鼠运动协调功能测试的好帮手与金标准

日期：2024-11-26 作者：

运动协调能力是指在身体运动过程中，调节与综合身体各个部分动作的能力，集灵敏度、速度、平衡能力等多种身体素质为一体，充分反映了中枢神经系统对肌肉活动的支配和调节功能。除了中枢神经病变外，机体代谢的病理改变会影响个体的运动协调功能，因此运动协调能力的测试往往可以反映机体的病理变化。

2024年3月，目前就职于清华大学的Zhang Ran博士以第一作者身份，在国际知名期刊Nature Metabolism（IF: 16.2）上发表了名为Regulation of urea cycle by reversible high-stoichiometry lysine succinylation的研究论文，通讯作者为加利福尼亚大学旧金山分校的Eric Verdin教授和巴克老龄化研究所的Birgit Schilling教授。其中，用于验证动物运动协调功能的实验部分使用了Ugo Basile的王牌产品之一——疲劳转棒仪。

研究背景

赖氨酸琥珀酰化修饰是一种蛋白质翻译后修饰，经过琥珀酰化修饰的蛋白，广泛参与各类包括三羧酸（TCA）循环、尿素循环、脂肪酸氧化和酮体合成等代谢途径。因此，琥珀酰化在代谢调节中起着多种潜在的重要作用，并与多种疾病的发病机制有关。

目前，利用抗体富集结合蛋白质组学分析技术，科研人员已能在细胞内识别出数千个琥珀酰化位点，但是判断其是否具有关键生物学意义较为困难。而本研究则通过探寻全局性鉴定细胞内蛋白质琥珀酰化水平的方法，快速寻找具有重要功能的高修饰率的琥珀酰化修饰位点。

实验方法

改进琥珀酰化修饰质谱样品的制备流程：采用GluC酶切的方式，发现在抗体富集后能够鉴定到与Trypsin数目相当的修饰位点，且GluC酶切鉴定到了大量全新的琥珀酰化修饰位点（673个）。

定量修饰率：对SIRT5 (琥珀酰化去修饰酶) WT/KO的鼠肝进行裂解，再用重标的d4-琥珀酸酐给蛋白全部引入重标的琥珀酰化修饰，经过GluC酶切后用SWATH-DIA进行检测，最后通过轻标和重标的琥珀酰化修饰肽的比值来确定修饰率。

表型运动协调功能鉴定：使用Ugo Basile疲劳转棒仪，分别在第1天、第14天和第28天进行测试。小鼠在实验前提前适应30分钟。每个测试包含训练阶段和实验阶段。在训练阶段中，小鼠在5 rpm恒定速度的转棒上停留5分钟，小鼠于转棒旋转前置于单独的通道中（单次实验最多可同时测试5只小鼠）。该实验将进行三次，每次间隔30分钟。每个实验阶段的前5秒中转棒持续缓慢旋转，在随后的6分钟内转棒转速从5rpm逐渐增加至50rpm,。如果小鼠从杆上掉落并被系统识别，实验会自动结束；当小鼠抱紧转杆并随之旋转时，实验则被人工记录结束。

实验结果

01.琥珀酰化修饰位点鉴定

鉴定出822个琥珀酰化修饰位点，进一步筛选出238个在抗体富集结果中也被鉴定到的位点，对这些修饰位点的修饰率进行分析后发现大多数位点修饰率都在0.1%-5%之间，有41个位点表现出>5%的修饰率。

02.SIRT5敲除后的修饰水平变化

ASS1蛋白的K112和K121在SIRT5敲除后有最大幅度的琥珀酰化修饰水平上升，分别从2.3%, 18.1%上升到了39.9%, 39.6%。

03.蛋白结构分析

只有K121位在ASS1蛋白的活性口袋周围，序列分析表明K112位在物种间并不保守，且只有K121E的突变体蛋白会导致ASS1的热稳定性和酶活显著下降，K112E的突变则基本无影响。

04.尿素循环代谢水平检测

敲除了SIRT5后的小鼠肝脏中尿素循环相关的代谢物水平明显下降，说明SIRT5敲除后细胞内ASS1活性的确降低了。同时作者发现，SIRT5的敲除导致了小鼠对氨的解毒能力下降，而在小鼠肝脏中对ASS1进行过表达则可以降低由于SIRT5敲低带来的氨水平上升。

实验结论

通过重标琥珀酸酐标记结合SWATH-DIA技术鉴定了鼠肝中琥珀酰化的修饰率，并从中找到了高修饰率蛋白ASS1。Ugo Basile疲劳转棒仪为表型运动协调功能鉴定提供了有力的工具，并为实验结论提供了重要支撑。

Ugo Basile疲劳转棒仪——经典易用，测试金标准

“转棒仪”技术起源于N.W.Dunham和T.S.Miya 于1957年发表的研究结果，已被证明在筛选对大小鼠运动协调和功能具有潜在活性的药物研究中有很大价值。Ugo Basile疲劳转棒仪是世界上首个根据此方法研发出的大小鼠转棒仪并将其命名为“Rota-Rod”，广泛应用于阿尔茨海默症、渐冻症、亨廷顿病脑损伤、焦虑抑郁症等神经科学领域研究，同时也可应用于其他探究运动协调功能的研究。

01.模式多样，满足不同需求
五种转动模式，用户可自定义实验协议，适配多种动物模型。可选择：恒定转速模式、线性加速模式、加速-减速模式、正反转模式及多段转动模式（此模式为用户自定义模式）。

02.多通道运行，支持多只动物同时实验

小鼠型转棒仪提供五通道，大鼠转棒仪提供四通道。每个通道的小鼠从转动的转棒上落到下面的跌落传感器时，设备自动记录转速和耐力时间。在多个动物测试结束时，显示屏显示每只动物的运动时间、旋转模式和落下时的旋转速度，以及用户预设的信息。

03.复合转轮，测试更灵敏
Ugo Basile公司与意大利卡梅里诺大学的Bellesi教授共同开发，在基础的转棒上可选配安装复合转轮后，可使原有均匀、连续的爬动表面转化为梯级式水平杆，这些水平杆的数量可以增加，可呈对称或不对称形式，以改变测试的复杂性。根据最近的发表文章显示，复合转轮提高了测试的灵敏度，甚至可以检测到运动缺陷的最小变化，特别适用于大鼠。

用于小鼠和大鼠的复合转轮RotaRod为小鼠和大鼠的运动协调测试引入了额外的复杂性，提高了测试灵敏度。动物在一个不规则的具有横条的转轮上行走，并且可通过随机拆除部分横条控制任务的难度，从而控制运动皮层和海马体的参与程度，大小鼠均有对应型号可选以提供最佳的实验效果。

04.应用领域广泛，文献引用量高
可应用于疲劳实验，骨骼肌松驰实验、中枢神经抑制实验，以及其它需用运动方式检测药物作用的实验，如毒性对运动能力的影响，体内物质缺乏对运动能力的影响，心脑血管药物对运动能力的影响等等。

通常可与其他行为学测试结合使用，如握力测试和悬尾测试，以测量动物肌肉功能、协调和平衡功能等。目前已有超过6,000篇同行评审文章引用，被誉为运动协调研究的金标准测试方法。

部分用户文献

1.Achilly NP, Wang W, Zoghbi HY. Presymptomatic training mitigates functional deficits in a mouse model of Rett syndrome. Nature. 2021;592(7855):596-600. doi:10.1038/s41586-021-03369-7

2.Lieb A, Qiu Y, Dixon CL, et al. Biochemical autoregulatory gene therapy for focal epilepsy. Nat Med. 2018;24(9):1324-1329. doi:10.1038/s41591-018-0103-x

3.Cocozza G, di Castro MA, Carbonari L, et al. Ca2+-activated K+ channels modulate microglia affecting motor neuron survival in hSOD1G93A mice. Brain Behav Immun. 2018;73:584-595. doi:10.1016/j.bbi.2018.07.002

4.Gautam M, Jara JH, Kocak N, et al. Mitochondria, ER, and nuclear membrane defects reveal early mechanisms for upper motor neuron vulnerability with respect to TDP-43 pathology. Acta Neuropathol. 2019;137(1):47-69. doi:10.1007/s00401-018-1934-8

5.Weston M, Kaserer T, Wu A, et al. Olanzapine: A potent agonist at the hM4D(Gi) DREADD amenable to clinical translation of chemogenetics. Sci Adv. 2019;5(4):eaaw1567. Published 2019 Apr 17. doi:10.1126/sciadv.aaw1567

6.Elorza A, Márquez Y, Cabrera JR, et al. Huntington's disease-specific mis-splicing unveils key effector genes and altered splicing factors. Brain. 2021;144(7):2009-2023. doi:10.1093/brain/awab087

7.Alonso Bellido IM, Posada-Pérez M, Hernández-Rasco F, et al. Microglial Caspase-3 is essential for modulating hippocampal neurogenesis. Brain Behav Immun. 2023;112:206-219. doi:10.1016/j.bbi.2023.06.013

8.Alonso Bellido IM, Posada-Pérez M, Hernández-Rasco F, et al. Microglial Caspase-3 is essential for modulating hippocampal neurogenesis. Brain Behav Immun. 2023;112:206-219. doi:10.1016/j.bbi.2023.06.013

9.Haigh JL, Adhikari A, Copping NA, et al. Deletion of a non-canonical regulatory sequence causes loss of Scn1a expression and epileptic phenotypes in mice. Genome Med. 2021;13(1):69. Published 2021 Apr 26. doi:10.1186/s13073-021-00884-0

10.Zhang Y, Mickle AD, Gutruf P, et al. Battery-free, fully implantable optofluidic cuff system for wireless optogenetic and pharmacological neuromodulation of peripheral nerves. Sci Adv. 2019;5(7):eaaw5296. Published 2019 Jul 5. doi:10.1126/sciadv.aaw5296